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Cruiser® 酶,核酸内切酶

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  • 沈阳莫德医药科技有限公司

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  • 产品说明

    ❀ 产品描述
        Cruiser® 酶,它是一种具天然强活性的核酸内切酶,与 CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链 DNA 的突变位点,并从突变位点的 3’-端高效地切割异源双链 DNA。吉锐生物根据 Cruiser® 酶的特性,自主研发出了两款产品:Cruiser®基因敲除检测试剂盒和 Cruiser™ Enzyme。能简便高效的检测基因敲除效率和基因多态性,广泛应用于精确检测人、哺乳动物、细菌、真菌、病毒以及植物基因敲除情况,尤其适用于 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9 实验中混合样本的突变效率的检测以及阳性克隆的筛选。
     

    ❀ 产品优势
    ●检测速度快:只需5~20 min,便可检测到各种类型的碱基突变,如:碱基替换、插入和缺失等;
    ●操作方便:无需胶回收纯化,PCR产物直接进行酶切验证;
    ●特异性高:精准切割突变位点,识别范围最小为1 bp的突变位点,最大可达上百bp的突变序列;
    ●检测方便:酶切后的PCR产物,可以通过常规琼脂糖凝胶电泳快速检测;
    ●混合样本分析:酶切分析混合样品(cell pool)的PCR产物,根据电泳结果计算突变率;
    ●高通量筛选:更加轻松地从大量样本中筛选阳性克隆。


    ❀应用方向
    ●用于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9实验中混合样品的敲除效率的检测;
    ●用于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9实验中阳性克隆的筛选。


    ❀实验案例

      Positive Control DNA 为杂交后的DNA片段,经Cruiser®核酸酶切割后形成三个明显片段,分别为393 bp、134 bp、259 bp,其中134 bp和259 bp片段是酶切后片段,而393 bp片段为杂交形成的homo-duplex DNA片段,无酶切割位点,因此,片段大小不变(见Figure1.)。
      
    Figure 1. 阳性对照和Pool检测的电泳结果       Figure 2. K562细胞中Atg10基因敲除案例

    上图中,M:100 bp-DNA Marker;   Positive:Positive Control DNA;   Pool:混合克隆;   Clone1-7:单克隆。


    A.混合样本分析:

       根据酶切后条带的亮度大致估测敲除效率,并送测序验证。因不同宿主物种中敲除载体的转染效率的差异,Pool验证阳性的可能性也会有较大差异,甚至存在Pool验证显示阴性,但最终却筛选到阳性克隆的情况,一般地,被转染的细胞比例越高,Pool检测越容易进行(见Figure1.)。 
             
                                                                                                                   
    B.单克隆结果分析:

    (1)如上图Figure2.所示为杂交后直接酶切的结果:clone3,5和6为潜在的阳性克隆,后续直接进行TA克隆和测序验证等位基因突变情况。

    (2)进一步对上述阴性单克隆间进行两两杂交反应(例如clone1与2杂交,clone4与7杂交……),再进行酶切,步骤如前述,然后再次电泳检测,结果分析如下:

    ①若电泳结果显示阴性,则可判定Clone A与Clone B均为野生型,即未敲除(当然不排除Clone A与Clone B均为纯合突变型且突变后序列完全一致,但几率较小,几乎为零,所以不考虑)。

    ②若电泳结果显示阳性(经验证明,这种情况几率也不是很大,此步骤能帮助筛选出两个亲本完全相同的敲除),则说明Clone A与Clone B中至少有一个为两个亲本相同KO情况的纯合突变型,此时可将Clone A、Clone B分别与野生型杂交,再进行一轮酶切验证即可,阳性克隆送测序验证突变情况。



    ❀说明书下载

    GP0102,GP0103-Genloci Cruiser Enzyme




    产品参数

    Q-1:PCR 反应后,电泳检测条带不亮,或者有杂带怎么办?

    A-1:建议在正式实验前先摸索好引物的PCR条件。

    ①若条带不亮,则更换引物,若是因为基因本身的序列问题(如GC含量高),无法找到合适的引物, 则取第一轮PCR产物l,以30μl体系扩增第二轮(见下图Figure 4.),再用二轮产物进行后续的酶切实 验。或者适当增加PCR循环数,比如40 cycles。

    ②若有杂带,则更换引物,若是因为基因本身的序列问题(如特异性较低),无法找到合适的引物,此 时若杂带的大小与Cruiser®酶切后产生的片段大小不同,则可以直接酶切(见下图Figure 5中红箭头处的条带大小则为杂带,而它与下端的酶切条带大小不一致,不影响判断)。

    ③若没有条带,则需要确认细胞是否为该物种名称的细胞,若用其它该物种的引物可以PCR出正确大 小的条带,则可以排除细胞错误的可能,需重新设计PCR用引物,或者尝试使用其它公司的高保真酶。



     

    Figure 4.扩增获得目的片段一轮PCR(上)和二轮PCR(下)电泳图


    Figure 5. PCR扩增目的片段有杂带,但不影响酶切的酶切电泳图


    Q-2:酶切后,电泳结果仅有原片段而无酶切条带?
    A-2:请先确定 Marker 是否明亮,阳性对照是否正常(阳性对照正常电泳图详见结果分析),未酶切前原PCR 片段是否明亮?若是因为以上原因造成酶切结果异常(无酶切条带、酶切条带较弱),请先按下图予以纠正。


    在 Marker 明亮,阳性对照明亮且已被切开,样品原条带明亮的情况下,样品没有酶切条带,则造成该 实验结果有以下几种可能:
    a.样品均为阴性,即 DNA 片段中无突变位点,可重新进行上游实验,也可通过对该 DNA 片段 进行测序验证;
    b.PCR 产物没有进行杂交,请检查反应底物是否经过杂交 DNA 步骤。
    c.所使用 PCR 用酶体系与 Cruiser®酶反应体系冲突,建议选购 Genloci Cruiser®基因敲除检测 试剂盒。
    d.DNA 片段中杂交 DNA 含量过低,致使反应后条带不易观察到。此情况应优先考虑改善杂交 条件,杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有条件的可使用金属浴或水浴退火。


     

    Q-3:酶切后,电泳结果中原片段明亮但酶切条带较弱?
    A-3:在 Marker 明亮,阳性对照明亮且已被切开,样品原条带明亮的情况下,样品酶切条带较弱,则可能是因为样品 DNA 片段中杂交 DNA 含量过低。该情况也常见于 cell pool 检测中,因 cell pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低,导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量 过少。此时建议加大底物量(10μl 的酶切体系所加的底物量最多不超过 7μl,所用 Cruiser®酶 1μl 量不变) 对于单克隆筛选中出现此中情况,应优先考虑改善杂交条件,杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有 条件的可使用金属浴或水浴退火。
      
    Q-4:酶切后,电泳结果酶切条带轻微弥散?
    A-4:该现象可能原因如下:
    当酶切后条带<200 bp,且经较长时间的核酸电泳,条带宽度变大,亮度不足时呈现类似弥散的带型; 当突变位点过长,尤其当突变长度达到 50 bp 以上时,酶切后条带易出现弥散现象,此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同,片段越小弥散情况越明显。
    原因可能如下:
     a.酶切后条带较小,在电泳时导致条带宽度变大造成弥散,使用更高浓度的琼脂糖凝胶,如 2%等;
     b.琼脂糖凝胶放置过久,推荐使用新配置的胶;
     c.样品有核酸酶污染;
     d.反应体系中 Mg2+的含量不足时,此时可以每 10μl 万博官方manbetx下载 3μl 5×Cruiser® Buffer;
     e.酶切反应结束要先等 PCR 仪温度降到 4℃后立即拿出加 2μl 6×Stop Buffer,随后立刻进行琼脂糖凝
    胶电泳检测或置于-20℃保存。

     


    Q-5:酶切后,电泳结果中酶切条带大小不是预期大小?
    A-5:出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点,可能性如下:
    ①制备的 DNA 片段存在其他 DNA 的污染,或者 KO 后缺失或者插入比较多长度,对于缺失或者插入 比较多的情况,单纯的 PCR 结束电泳检测即可肉眼分别出阳性,cruiser 酶切可再次验证阳性;
    ②根据酶切结果:若酶切后形成的各条带单一,则在 DNA 片段上可能含有其他杂交位点,需通过进一 步 DNA 测序检测;若形成的酶切条带数量远多于预期,且随机分布含一定弥散,则可能是 DNA 片段扩增 中,DNA 聚合酶错配扩增导致,更换高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响;
    ③如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带,也会导致同样情况,解决方案见 FAQ 中的 Q-1 中有杂带 的情况。


    Q-6:酶切后,如何使电泳图酶切条带更亮?
    A-6:为了改善酶切效果,使酶切出的条带更亮一点,通常采取以下措施:

    ①优先考虑改善杂交条件:杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有条件的可使用金属或水浴退火;
    ②适当增加酶切底物量,如 2μl 增加至 5μl,最多不超过 7μl(以 10μl 酶切体系不变)
    ④增加样品 DNA 浓度:PCR 反应再扩增一轮。


    Q-7:Cruiser® Enzyme 检测结果是否会出现假阳性?
    A-7:Cruiser®  Enzyme 是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶,具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性,它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止,尚未有文献报道使用 Cruiser® Enzyme 或 Cel I 会出现假阳性。


    Q-8:酶切后,电泳结果中酶切条带大小与预期一致,就一定是纯合子吗?
    A-8:因为杂交的 DNA 片段是通过 PCR 得到的,所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切条带 后,不能 100%判断该样本为纯合子,因为杂合子也能得出同样的结果。因此,需要对 PCR 片段进行的 TA克隆和测序分析。


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