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激光共聚焦(LSCM)检测

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  • 北京嘉美臻元生物技术有限公司

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    一、实验技术简介

    激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块(包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器)、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备(显示器、彩色打印机)等。通过激光扫描共聚焦显微镜,可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此,可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时,通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
     
     

     
    二、主要技术指标
    1、共聚焦扫描系统
    (1)独立双向扫描镜。可以在正置显微镜和倒置显微镜之间迅速互换。仪器永久不用校正;可调的计算机控制单共焦针孔、孔径20~600μm
    (2)光谱扫描区400~850nm
    (3)单线扫描频率≥2000线/秒
    (4)图扫描率≥3幅/秒512×512pixels;≥20幅/秒512×32pixels
    (5)扫描分辨率4096*4096扫描放大1~32X;多方位序列扫描方式;任意形状区域扫描-范围:≥22mm。
    (6)光谱斜陡率  ≤1%
    (7)透射光检测器用于微分干涉相衬法检验
    (8)低噪音 冷却型光电倍增管(PNT)控测器12bi
     
    2、激光装置:具有多通道AOTF(四通道,八谱线),连接四种不同波长的可见光激光可以自动选择激光谱线和功率,具等待功能。光纤耦合连接低能量激光。目前使用五激光,八谱线。Ar激光发生器 (458nm/5mw,476nm/5mw,488nm/20mw,514nm/20mw)-蓝;He/Ne激光发生器(543nm/1.2mw)-绿;He/Ne激光发生器(633nm/10mw,594nm/2mv)-红,紫外激光发生器(405nm/25mv)
     
    3、显微镜:DMIRE2倒置电动荧光显微镜,拥有10x,20x,40x干镜以及63x,100x油镜。配置电动编码物镜转座,Z轴电动驱动和干涉相衬的编码棱镜转轮。
     
    4、计算机工作站:WindowsXP操作系统,8个同步接收器通道,12bit同步数字转换,超宽的SCSI电脑介面,高性能的电脑工作站,两个监视器,计算机彩色显示
     
    5、主要附件和功能:观察细胞精细结构。用于检测各种染色,非染色和荧光标记的组织和细胞等,在可见光范围内荧光的定位定量分析,组织光学切片,基因染色体定位,基因亚细胞定位,离子通道研究.
     
    三、检测的优势
    与传统光学显微镜相比,主要解决了生物样品结构相互重叠影响观察的问题,并可形成清晰的三维图象。在检测方面的主要优势有:
    1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的单个或一群细胞或者观察到局部组织的各个层面结构(包括细胞特异结构—细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统,样品的深层结构)的三维图像。
    2、细胞内离子荧光标记,单标记或三奈记,检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。
    3、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体,核酸等观察;可以在同一张样品上进行同时多重物质标记,同时观察;
    4、荧光检测快、激发光强度精确控制、光漂白和荧光淬灭作用小;
    5、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性;数据图象可及时输出或长期储存。
     
    四、样品要求
    样品制备无特殊要求;各种染色、非染色、荧光标记的组织(包括活组织)、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。
    1、石蜡切片
    取材:1、组织离体后需及时固定;2、组织标本不宜过大、过厚。
    固定:1、固定液:10%福尔马林(4%多聚甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1~20:1;3、固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
    保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。

    2、冰冻切片
    取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
    固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。
    保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。

    3、细胞块石蜡切片
    细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

    4、细胞爬片
    在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。

    5、细胞涂片
    细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋酸液、乙醚-酒精液和Carney’s液等。 
     
     
    五、注意事项
    1、常用的固定液为中性甲醛和4%多聚甲醛,能使大多数抗原保存良好,适用于免疫组织化学。
    2、病理实验切片最好是防脱片,以免实验过程中出现掉片。若客户提供切片,应告知切片有无防脱处理。
    3、骨组织、皮肤组织或脂肪含量较高的样本,实验过程中有较高的掉片几率。
    4、客户可提供组织块(以10%福尔马林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定,如组织块极小请事先说明)、蜡块或切片(使用免疫组化专用切片,以避免实验过程中掉片)
    5、待检测蛋白的种属、实验分组情况及实验背景资料、其他具体要求等需事先说明。
    6、若客户提供骨组织或钙化程度较高的组织进行实验,需进行脱钙处理。
    7、浸泡在固定液中的组织样本,在运输中容器需密封,防止破碎、渗漏。
     
    、应用领域
    1、细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡; 
    2、生物化学:酶、核酸、FISH(荧光原位杂交)、受体分析
    3、药理学:药物对细胞的作用及其动力学;
    4、生理学:膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态;
    5、遗传学和组胚学:细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因万博博彩官网、基因诊断;
    6、神经生物学:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、 神经组织(如大脑皮质)结构、细胞分布;
    7、微生物学和寄生虫学:细菌、寄生虫形态结构(表面和内部结构);
    8、病理学及病理学临床应用:活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断,HIV,宫颈上皮细胞涂片诊断;
    9、生物学、免疫学、环境医学和营养学。


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